降钙素基因相关肽对高脂复合缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究表明，结扎冠状动脉可诱发大鼠传入神经纤维末梢逆向释放降钙素基因相关肽，提示降钙素基因相关肽参与了急性心肌缺血的病理生理过程。

目的：观察降钙素基因相关肽对氧化低密度脂蛋白孵育缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响。

方法：20孔原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为5组：正常对照组、氧化低密度脂蛋白组、氧化低密度脂蛋白+缺氧/复氧组、降钙素基因相关肽组和CGRP_8-37组。后4组均用氧化低密度脂蛋白孵育24 h，再建立心肌细胞缺氧/复氧模型；降钙素基因相关肽组在缺氧/复氧前30 min加入10^-8 mol/L 降钙素基因相关肽，CGRP_8-37组在给予降钙素基因相关肽前30 min加入10^-7 mol/L的降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP_8-37。采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率并测定caspase-3活性。

结果与结论：降钙素基因相关肽能明显抑制氧化低密度脂蛋白和缺氧/复氧处理的乳鼠心肌细胞caspase-3的激活，从而阻止凋亡的发生，并且该作用能被降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP_8-37部分逆转，说明降钙素基因相关肽通过与降钙素基因相关肽1受体结合产生抗凋亡效应，进而抑制心肌细胞凋亡，对氧化低密度脂蛋白孵育乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 降钙素基因相关肽, 心肌细胞, 缺氧/复氧, 细胞凋亡, 氧化低密度脂蛋白, caspase-3, 鼠, 高脂血症

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that calcitonin gene-related peptide can be released from cardiac sensory afferent terminals following coronary artery occlusion in rats, indicating the involvement of calcitonin gene-related peptide during pathological process of acute myocardial ischemia.

OBJECTIVE: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide on neonatal rat cardiomyocytes apoptosis induced by oxidized low-density lipoprotein and hypoxia/reoxygenation.

METHODS: Twenty wells of primary cultured neonatal rat myocardial cells were randomly divided into five groups: normal control group, oxidized low-density lipoprotein group, oxidized low-density lipoprotein hypoxia/reoxygenation group, calcitonin gene-related peptide group and calcitonin gene-related peptide_8-37 group. The cells in the last four groups were incubated with oxidized low-density lipoprotein for 24 hours before establishing the myocardial hypoxia/reoxygenation model. At 30 minutes prior to hypoxia/reoxygenation, 10^-8 mol/L calcitonin gene-related peptide were added into the culture fluid in calcitonin gene-related peptide group; 10^-7 mol/L competitive antagonist calcitonin gene-related peptide_8-37 of calcitonin gene-related peptide-1 receptor were added at 30 minutes before calcitonin gene-related peptide administration in calcitonin gene-related peptide_8-37 group. Myocardial apoptotic rate and caspase-3 activity were detected respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Calcitonin gene-related peptide could significantly attenuate apoptosis of neonatal rat myocardial cells through inhibiting the caspase-3 activation induced by oxidized low-density lipoprotein and hypoxia/reoxygenation. And this effect could be partially reversed by competitive antagonist calcitonin gene-related peptide_8-37 of calcitonin gene-related peptide 1 receptor, indicating that calcitonin gene-related peptide has anti-apoptotic effect in combination with the calcitonin gene-related peptide 1 receptor to inhibit cardiomyocyte apoptosis in neonatal rats induced by oxidized low-density lipoprotein and hypoxia/reoxygenation.

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Key words: calcitonin gene-related peptide, apoptosis, myocytes, cardiac, anoxia

中图分类号:

R318

岳维，朱国斌，杜秋香，郭政. 降钙素基因相关肽对高脂复合缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1761-1764.

Yue Wei, Zhu Guo-bin, Du Qiu-xiang, Guo Zheng. Calcitonin gene-related peptide affects cardiomyocyte apoptosis of neonatal rats induced by oxidized low-density lipoprotein and hypoxia/reoxygenation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1761-1764.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation. 1997;95(2):320-323.

[2] 张建文,郭政.吗啡预先给药对急性心肌缺血大鼠心肌P物质和降钙素基因相关肽的影响[J].中华麻醉学杂志, 2006,26(10): 911-914.

[3] Brady NR, Hamacher-Brady A, Gottlieb RA.Proapoptotic BCL-2 family members and mitochondrial dysfunction during ischemia/reperfusion injury, a study employing cardiac HL-1 cells and GFP biosensors.Biochim Biophys Acta. 2006;1757 (5-6):667-678.

[4] Haunstetter A, Izumo S.Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease.Circ Res. 1998;82(11): 1111-1129.

[5] Kita T, Kume N, Minami M,et al.Role of oxidized LDL in atherosclerosis.Ann N Y Acad Sci. 2001;947:199-205; discussion 205-206.

[6] Ehara S, Ueda M, Naruko T, et al.Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes.Circulation. 2001; 103(15):1955-1960.

[7] Ekmekcioglu C, Mehrabi MR, Glogar HD,et al.Oxidized low-density lipoprotein is localized in the ventricles of hearts from patients with coronary heart disease.Int J Clin Lab Res. 2000;30(3):133-140.

[8] Iwai-Kanai E, Hasegawa K, Sawamura T,et al.Activation of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 induces apoptosis in cultured neonatal rat cardiac myocytes.Circulation. 2001;104(24):2948-2954.

[9] Guo J, Li HZ, Zhang WH, et al.Increased expression of calcium-sensing receptors induced by ox-LDL amplifies apoptosis of cardiomyocytes during simulated ischaemia-reperfusion.Clin Exp Pharmacol Physiol. 2010; 37(3):e128-135.

[10] Hoover DB, Chang Y, Hancock JC,et al.Actions of tachykinins within the heart and their relevance to cardiovascular disease.Jpn J Pharmacol. 2000;84(4):367-373.

[11] 商立军,臧益民,王春梅,等.降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响[J].第四军医大学学报, 2000,21(4): 903-905.

[12] Wu DM, van Zwieten PA, Doods HN.Effects of calcitonin gene-related peptide and BIBN4096BS on myocardial ischemia in anesthetized rats.Acta Pharmacol Sin. 2001; 22(7):588-594.

引言

材料方法

设计：细胞水平体外实验。

材料：

实验动物：1-3 d龄的SD大鼠，雌雄不拘，由山西医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

原代心肌细胞培养：无菌条件下取大鼠心室剪碎成约 1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，用0.08%胰酶溶液反复消化、分离、收集，加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。用差速贴壁分离法去除贴壁的非心肌细胞，按5.0×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔培养板，在37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中培养，每24 h换培养基1次。在最初48 h于培养基中加入0.1 mmol/L的5-溴脱氧嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长。将培养72 h、生长呈亚融合状态且同步搏动良好的心肌细胞用于实验。

心肌细胞缺氧/复氧模型的制备：参照文献[3]建立细胞缺氧/复氧模型。模拟缺氧：培养的心肌细胞更换经缺氧处理的低糖DMEM(提前用体积分数95%N₂+5%CO₂饱和 3 h)，置于无菌密闭容器，进气口通入体积分数95%N₂+5%CO₂混合气体，37 ℃孵育3 h。模拟复氧：将缺氧心肌细胞的培养液换成高糖DMEM培养液，常规培养9 h。

分组及给药：20孔细胞随机分为5组(n=4)：①正常对照组：不做任何处理。②氧化低密度脂蛋白组：培养液中加入终浓度50 mg/L的氧化低密度脂蛋白孵育24 h。③氧化低密度脂蛋白+缺氧/复氧组：氧化低密度脂蛋白孵育24 h后实施缺氧/复氧。④降钙素基因相关肽组：在氧化低密度脂蛋白孵育24 h后，实施缺氧/复氧前30 min加入终浓度10^-⁸ mol/L的降钙素基因相关肽。⑤CGRP_8-37组：在④的基础上给予降钙素基因相关肽前30 min加入终浓度10^-⁷ mol/L的降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP_8-37。药物浓度的选择基于预实验研究结果。取样本进行下述指标的测定。

主要观察指标：

流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。取单细胞悬液100 µL，用Annexin V/PI双染色法(北京四正柏公司)进行荧光标记，采用FACS Calibur流式细胞仪进行检测。数据采用Cell Quest专用软件进行分析，通过计数凋亡区细胞数量得出凋亡率(AR)。

心肌细胞Caspase-3活性测定：用胰酶消化并收集细胞，冰浴裂解30 min，4 ℃离心(10 000 r/min，20 min)后取上清。严格按照Caspase-3调亡检测试剂盒操作程序进行Caspase-3活性检测。

用酶标仪测定吸光度值(405 nm)。另外，取5 µL样品用BCA法测定蛋白浓度。实验孔的吸光值减去背景孔的吸光度值/蛋白含量为Caspase-3活性的绝对值，实验结果Caspase-3活性采用比活性的方式表示，以正常对照组Caspase-3活性的平均值为标准，其它组Caspase-3活性均以此为标准进行校正。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

凋亡和坏死是缺血早期心肌细胞损伤的主要形式，预防和减少心肌细胞的凋亡对缺血性心肌病的预后和转归有重要意义^[1]。Caspase是调亡发生过程中所需的重要的金属蛋白酶，其中Caspase-3的激活是调亡发生过程中蛋白级联反应的限速酶，也是细胞凋亡的主要效应因子和执行者^[4]。

氧化低密度脂蛋白在致动脉粥样硬化的病理过程中起关键作用^[5]。急性冠脉综合征患者血浆中氧化低密度脂蛋白显著升高，并且在缺血再灌注组织中含有大量氧化低密度脂蛋白^[6-7]。研究表明，氧化低密度脂蛋白可通过其受体LOX-1介导氧化应激，并导致内皮细胞、平滑肌细胞和单核巨噬细胞凋亡^[8]。近年来发现氧化低密度脂蛋白也能够造成心肌损害。Guo等^[9]发现氧化低密度脂蛋白可上调心肌细胞细胞色素c(cyt-c)、Bax和活化caspase-3的表达，下调Bcl-2的表达，导致凋亡增多。同样实验结果也观察到：原代培养的乳鼠心肌细胞用氧化低密度脂蛋白处理后，细胞凋亡率升高，caspase-3活性升高，提示氧化低密度脂蛋白致心肌细胞损伤的机制与细胞凋亡有关。

在氧化低密度脂蛋白导致心肌细胞损伤基础上，实验又加入了缺氧/复氧干预因素模拟缺血再灌注损伤。结果显示氧化低密度脂蛋白缺氧/复氧组较单纯氧化低密度脂蛋白组caspase-3活性明显升高，凋亡进一步加重。表明氧化低密度脂蛋白和缺氧/复氧处理可协同促进培养的乳鼠心肌细胞凋亡，是缺氧所致高脂血症心肌细胞损害的分子机制之一。

降钙素基因相关肽是由Aδ和C类感觉传入纤维储存并释放，广泛分布于心脏及冠脉系统^[10]。实验室前期研究结果表明，结扎冠状动脉可诱发大鼠心肌组织降钙素基因相关肽水平显著升高，提示降钙素基因相关肽参与了急性心肌缺血的病理生理过程^[2]。在大鼠离体心脏灌流和冠脉结扎模型已证实降钙素基因相关肽产生舒血管和正性变时变力效应；多数学者认为降钙素基因相关肽对急性缺血、缺氧状态下的心肌细胞具有保护作用，还可以显著减轻心肌缺血-再灌注损伤^[11-12]，但是，其作用机制尚未完全阐明。实验结果表明，降钙素基因相关肽能明显抑制氧化低密度脂蛋白和缺氧/复氧处理的乳鼠心肌细胞caspase-3的激活，从而阻止凋亡的发生，并且该作用能被降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP_8-37部分逆转，进一步说明降钙素基因相关肽是通过与降钙素基因相关肽1受体结合产生抗凋亡效应，从而发挥对心肌细胞的保护作用。

综上所述，降钙素基因相关肽对氧化低密度脂蛋白孵育的乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用，其机制可能与降钙素基因相关肽1受体结合抑制心肌细胞凋亡有关。

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全文链接：

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[3]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[4]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[5]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[6]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[7]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[8]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[9]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[10]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[11]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[12]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[13]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[14]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[15]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.